种生基起效时限_种生基的步骤方法和时间

基于基因工程技术将编码蛋白的DNA序列插入合适的载体后导入宿主细胞，用于表达大量蛋白质的方法称为蛋白质重组表达技术。按照宿主细胞来划分，蛋白质表达系统可以分为原核表达系统和真核表达系统两大类，根据目的蛋白质的性质和实验目的选择合适的表达系统。

一、原核表达系统存在一定局限性：

原核表达系统虽然是常见的表达系统，但不具有蛋白质的翻译后修饰及加工，存在局限性:

1.目的蛋白常以包涵体形式表达，导致产物纯化困难

2.原核表达系统的翻译后加工修饰体系不完善,不能进行糖基化、甲基化修饰，影响某些表达产物的生物活性。

3.细菌内毒素的影响

4.对于表达的真核蛋白来说，不仅易被细菌蛋白酶降解，而且难实现真正的分泌出胞，其产量很低。

二、真核表达系统具有明显的优势和必要性：

1、具有转录后加工系统

2、具有翻译后修饰系统

3、可实现真正的分泌表达

真核表达系统具有翻译后的加工修饰体系，表达的外源蛋白更接近于天然蛋白质。利用真核表达系统可以诱导高效表达，加快人们对基因研究以及药物研究的进程。基因工程中常用的真核表达系统有:酵母表达系统、昆虫细胞表达系统及哺乳动物细胞表达系统，我会分别介绍这三个表达系统，先来讲讲酵母表达系统：

酵母是蛋白表达宿主细胞的良好选择。酵母细胞发酵简单、快速、便宜，易于遗传操作，具有蛋白质翻译后修饰功能，可分泌表达，纯化工艺简单且安全。酿酒酵母是异源蛋白质生产最早开始使用的酵母宿主。最近，其它酵母如毕赤酵母，乳酸克鲁维酵母，和解脂耶氏酵母已成为有利的宿主细胞。对于酵母表达系统，主要介绍酵母受体细胞以及酵母载体：

一、酵母受体细胞 ：

1.酿酒酵母：胰岛素和胰高血糖素是使用酿酒酵母作为宿主而工业生产出来的。

特点：较早使用，了解较为清楚；安全性高，被FDA确认为安全生物，但蛋白质表达量较低，易产生过量糖基化，转化子不稳定，易发生质粒丢失

2.毕赤酵母：巴斯德毕赤酵母作为第二代酵母表达系统，其优势体现在遗传操作更加简易，蛋白表达水平更高，对蛋白修饰能力更强，例如O-糖基化、N-糖基化和二硫键形成，人血清白蛋白，乙型肝炎疫苗，干扰素，胰蛋白酶等以毕赤酵母作为宿主生产。毕赤酵母作为专性需氧酵母，可以使用甲醇作为碳源；是可诱导的AOX1启动子表达系统；具有较高的重组滴度，在呼吸条件下不会通过产生乙醇而损失碳源，导致更高的生物量形成，产生更多的重组蛋白

3、乳酸克鲁维酵母：在工业上，乳酸克鲁维酵母以分泌β-半乳糖苷酶而著称，以乳酸克鲁维酵母为宿主产生的第一个重组蛋白是牛凝乳酶。乳酸克鲁维酵母相对于酿酒酵母作为宿主的另一个优势是它通过糖酵解和戊糖磷酸途径代谢己糖。

4、解脂耶氏酵母：解脂耶氏酵母以碳氢化合物 作为碳源的能力而闻名。据报道它分泌高水平的天然和异源蛋白质。例如，解脂耶氏酵母的野生型菌株可以释放1-2g/L的碱性细胞外蛋白酶

二、酵母载体

1、概念：携带外源基因在酵母细胞中复制、扩增和表达的载体，包括克隆载体和表达载体

2、组成元件：选择标记、调控序列

1）选择标记：选择标记是载体转化酵母时筛选转化子所必须的元件，用于重组子的筛选和鉴定，并且通常是显性，营养缺陷或自选标记。选择标记的消除可使用Cre-loxP系统。 。选择标记可分为两类：

a.营养缺陷型筛选标记：如HIS3，HIS4，LEU2，LYS2，TRP1，URA3等；

b.抗生素筛选标记：氯霉素，G418，Zeocin等；

在酿酒酵母和乳酸克鲁维酵母，LEU2基因和G418抗性基因是最常用，对于解脂耶氏酵母，主要使用LEU2和URA3基因。在毕赤酵母中，最常使用HIS4和zeocin。

2）调控序列：包括启动子、ARS 、2μM质粒、酵母着丝粒区段(CEN)等

①启动子：可分为两类，组成型启动子提供简单性和相对恒定的表达水平，而当需要分离生长和生产时通常使用诱导型启动子，这能防止无意中选择生长较快的非重组细胞或产生毒性蛋白。不同的受体细胞常用的启动子如表中所示, PGK(磷酸甘油激酶)、GAP(3-磷酸甘油醛脱氢酶)、ADH(醇脱氢酶)，G3P ，ICL1 ，ADH3启动子 ，AOX1 ，TEF ，GAL1 等都是常用的启动子。

酿酒酵母中，半乳糖诱导的GAL1和GAL10启动子常用；在乳酸克鲁维酵母中，经常依赖于酿酒酵母的启动子，例如GAL1或PGK；毕赤酵母常用甲醇诱导型启动子AOX1

②ARS：酵母复制起始区(点)

③2μM质粒：酵母核质中的小的环状DNA，可以独立复制并转录

④酵母着丝粒区段(CEN): 增加转化子稳定性

3、酵母载体的类型

包括酵母克隆载体、酵母表达载体以及酵母人工染色体(YAC)

1).酵母克隆载体：不含酵母启动子，不能在酵母中表达外源基因，可分为两类

a.酵母整合型质粒( yeast integrated plasmid. YIp):带有一个酵母URA3标志基因和大肠杆菌的复制和报告基因。由于质粒DNA与酵母基因组DNA之间发生了同源重组，在转化的细胞中可以检测到质粒的整合复制，转化子稳定，但转化率极低。

b.酵母复制型质粒(Yeast replicable plasmid, YRp):该类载体在酵母中可以自我复制，主要有YRp、YEp和YCp

酵母复制质粒 ：细茵质粒DNA+酵母遗传标记+酵母复制序列(ARS),可自主复制，但稳定性差

酵母附加型质粒 :细菌质粒DNA+酵母标记基因+酵母2 μM质粒，游离于核外存在并自主复制，稳定性好。2μm质粒含有自主复制起始区(ori)和STB区，STB序列能够使质粒在供体细胞中维持稳定

酵母着丝粒质粒 ：该载体除含复制起点外，还有酵母菌染色体着丝粒 ，因而能在染色体外自我复制，拷贝数低但很稳定，适合作亚克隆载体和构建酵母菌基因组DNA文库

YIp:带有一个酵母标志基因；

YRp：在YIp的基础上 酵母复制序列(ARS)；

YEp:在YIp的基础上 酵母2μM质粒

2）酵母表达载体 ：含酵母启动子，酵母表达系统的载体一般是穿梭质粒，能在酵母菌和大肠杆菌中进行复制。

酿酒酵母表达系统中重组蛋白的生产可以使用三种类型的载体完成：整合质粒 ，附加型质粒 和着丝粒质粒 。在非常规酵母中，质粒选择受到更多限制。虽然质粒可用于三种非常规酵母，但它们的拷贝数往往较低，并且易突变。因此，基因组整合仍是首选。

毕赤酵母表达系统中常用的包括分泌表达载体和非分泌型表达载体两种

毕赤酵母分泌表达载体

pPICZα A、B 和 C 载体用于表达和分泌毕赤酵母中的重组蛋白，可用于任何毕赤酵母菌株，包括 X-33、SMD1168H 和 KM71H等。

pPICZα 载体包含以下元素：

• AOX1 启动子，对相关基因进行严格调控，保证甲醇诱导表达

• 用于重组蛋白分泌的α-因子分泌信号

• Zeocin 基因用于大肠杆菌和毕赤酵母中的筛选

含有 c-myc 抗原决定簇和(6xHis) 标签的 C 端肽用于检测和纯化重组融合蛋白

毕赤酵母非分泌型表达载体：

pGAPZ A，B，和C载体 使用GAP启动子在毕赤酵母中稳定表达重组蛋白。GAP启动子的重组蛋白表达水平略高于AOX1启动子。与诱导型启动子对比，组成型启动子可以利用更多的碳源在毕赤酵母中表达外源蛋白。重组蛋白表达为带有C端His标签的融合蛋白。Zeocin 的筛选标记可以同时使用于毕赤酵母和大肠杆菌。

3）酵母人工染色体

酵母人工染色体 ，是一种能够克隆长达400Kb的DNA片段的载体，含有酵母细胞中必需的端粒、着丝点和复制起始序列，是细胞内具有遗传性质的物体，易被碱性染料染成深色，所以叫染色体

特点：容量大 、用于有丝分裂和减数分裂功能的着丝粒 和两个端粒

端粒重复序列 ：定位于染色体末端一段序列，用于保护线状的DNA 不被胞内的核酸酶降解，以形成稳定的结构。

着丝粒 ：有丝分裂过程中纺锤丝的结合位点，使染色体在分裂过程中能正确分配到子细胞中。在 YAC 中起到保证一个细胞内只有一个人工染色体的作用。如 pYAC4 使用的是酵母第四条染色体的着丝粒。

自主复制序列 ：一段特殊的序列，含有酵母菌中 DNA 进行双向复制所必须的信号

在YAC载体中最常用的是pYAC4 。由于酵母的染色体是线状的，因此其在工作状态也是线状的。但是，为了方便制备YAC载体，YAC载体以环状的方式存在，并增加了普通大肠杆菌质粒载体的复制元件和选择标记。

三、酵母表达系统中的翻译后修饰

在酵母中，最常见的翻译后修饰包括乙酰化，酰胺化，羟基化，甲基化，N-糖基化，O-糖基化，磷酸化，吡咯烷酮羧酸，硫酸化和泛素化

酿酒酵母已知会 200个甘露糖残基，导致蛋白的超糖基化，与酿酒酵母相比，毕赤酵母的糖基化程度下降。为了克服糖基化的类型和程度，已报道通过基因修饰毕赤酵母创建一个类似于哺乳动物宿主的糖基化模式。在乳酸克鲁维酵母中，N-糖基化过程加了大约30个甘露糖残基。因此，与酿酒酵母相比，当乳酸克鲁维酵母用作宿主时，重组蛋白的免疫原性较低。

四、转化

转化方法常用的有三种：具体如下

1.电穿孔法：效率较高，整合型载体转化前要酶切线性化

2.LiCl法：做成感受态细胞

3、原生质体法：去除厚壁

参考文献：

[1]Antonio V G , Talita S C , Lucas S C , et al. Comparison of Yeasts as Hosts for Recombinant Protein Production[J]. Microorganisms, 2025 , 6(2):38-.

[2]Roghayyeh, Baghban, Safar, et al. Yeast Expression Systems: Overview and Recent Advances.[J]. Molecular biotechnology, 2025 .